Como Realizar uma Análise Espectrofotométrica: 13 Passos (com Imagens)

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A espectrofotometria é uma técnica experimental usada para medir a concentração de solutos em uma solução específica, calculando a quantidade de luz absorvida por esses solutos. Esta técnica é poderosa porque certos compostos absorvem diferentes comprimentos de onda de luz com diferentes intensidades. Ao analisar a luz que passa pela solução, você pode identificar certos solutos em solução e quão concentradas essas substâncias estão. Um espectrofotômetro é o dispositivo usado para analisar soluções em um ambiente de laboratório.

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Parte 1 de 3: Preparando as amostras

Imagem intitulada Do Spectrophotometric Analysis Step 1

1. Ligue o espectrofotômetro. A maioria dos espectrofotômetros precisa aquecer antes de poder fornecer uma leitura precisa. Ligue o dispositivo e deixe-o descansar por pelo menos 15 minutos antes de executar as amostras.

Use o tempo de aquecimento para preparar suas amostras.

Imagem intitulada Do Spectrophotometric Analysis Step 2

2. Limpe as cuvetes ou tubos de ensaio. Se você estiver fazendo um laboratório escolar, pode estar usando tubos de ensaio descartáveis que não precisam ser limpos. Se você usar cuvetes ou tubos de ensaio reutilizáveis, certifique-se de que estejam bem limpos antes de usar. Enxaguar bem cada cuvete com água desionizada.

Tenha cuidado com as cubetas, pois podem ser bastante caras, especialmente se forem feitas de vidro ou quartzo. As cubetas de quartzo são projetadas para uso em espectrofotometria UV-visível.

Ao manusear a cuvete, não toque nos lados por onde a luz passará (geralmente, os lados transparentes do tubo). Se tocar acidentalmente nestes lados, limpe a cuvete com um `kimwipe` (que são formulados para evitar riscar o vidro).

Imagem intitulada Do Spectrophotometric Analysis Step 3

3. Carregue o volume apropriado de amostra na cubeta. Algumas cubetas têm um volume máximo de 1 mililitro (mL), enquanto os tubos de ensaio podem ter um volume máximo de 5 mL. Desde que o laser que produz a luz passe pelo líquido e não por uma parte vazia do recipiente, você terá uma leitura precisa.

Se você usar uma pipeta para carregar suas amostras, use uma nova ponta para cada amostra para evitar contaminação cruzada.

Imagem intitulada Do Spectrophotometric Analysis Step 4

4. Faça uma solução de controle. A solução controle, ou `em branco`, possui apenas o solvente químico no qual a solução a ser analisada é dissolvida. Por exemplo, se você dissolver sal em água, seu `branco` conterá apenas água. Se você colorir a água de vermelho, o branco também deve conter água vermelha. O branco tem o mesmo volume da solução a ser analisada e é mantido no mesmo tipo de recipiente.

Imagem intitulada Do Spectrophotometric Analysis Step 5

5. Limpe a parte externa da cubeta. Antes de colocar a cubeta no espectrofotômetro, certifique-se de que ela esteja o mais limpa possível para evitar interferência de partículas de sujeira ou poeira. Use um pano sem fiapos para remover quaisquer gotas de água ou poeira que possam estar na parte externa da cubeta.

Parte 2 de 3: Executando o experimento

Imagem intitulada Do Spectrophotometric Analysis Step 6

1. Escolha e defina o comprimento de onda da luz para analisar a amostra com. Use um único comprimento de onda de luz (cor monocromática) para tornar o teste mais eficaz. A cor da luz deve ser uma cor conhecida por ser absorvida por um dos produtos químicos suspeitos de estar presente na solução de ensaio. Defina o comprimento de onda desejado de acordo com as especificações do seu espectrofotômetro.

Em um laboratório de sala de aula, o comprimento de onda provavelmente será dado.
Como a amostra refletirá toda a luz da mesma cor quando aparecer, o comprimento de onda experimental sempre será de uma cor diferente daquela da amostra.
Os objetos aparecem como certas cores porque refletem a luz de certos comprimentos de onda e absorvem todas as outras cores. A grama é verde porque a clorofila na grama reflete a luz verde e absorve todo o resto.

Imagem intitulada Do Spectrophotometric Analysis Step 7

2. Calibre a máquina com o `em branco`. Coloque o branco no suporte da cuvete e feche a tampa. Em um espectrofotômetro analógico haverá uma tela com uma agulha que se move com base na intensidade da detecção de luz. Quando o espaço em branco estiver dentro, você deverá ver a agulha se mover para a direita. Anote este valor caso precise dele mais tarde. Com o blank ainda na máquina, coloque a agulha em zero com o botão de ajuste.

Os espectrofotômetros digitais podem ser calibrados da mesma forma, eles só terão uma leitura digital. Defina o branco para zero com os botões de ajuste.

Quando você remove o branco, a calibração ainda está correta. Ao medir o resto das amostras, a absorbância do branco é automaticamente subtraída.

Certifique-se de usar um único branco por sessão para que cada amostra seja calibrada para o mesmo branco. Por exemplo, se você esvaziar o espectrofotômetro, analisar apenas algumas amostras e esvaziar o espectrofotômetro novamente, as amostras restantes serão imprecisas. Então você tem que começar de novo.

Imagem intitulada Do Spectrophotometric Analysis Step 8

3. Remova o branco e teste a calibração. Com o branco removido, a agulha deve permanecer em 0 (zero) ou a leitura digital deve permanecer em zero. Coloque o branco de volta no dispositivo e verifique se a agulha ou a leitura não mudam. Se a máquina estiver devidamente calibrada com seu blank, tudo deve ficar em zero.

Se a agulha ou leitura não for zero, repita as etapas de calibração com o branco.

Se você continuar a ter problemas, obtenha ajuda ou verifique se há problemas no dispositivo.

Imagem intitulada Do Spectrophotometric Analysis Step 9

4. Meça a absorbância da sua amostra experimental. Remova o branco e coloque a amostra experimental no dispositivo. Deslize a cubeta na ranhura apropriada e certifique-se de que esteja na vertical. Aguarde cerca de 10 segundos para a agulha parar ou para os números digitais pararem de mudar. Observe os valores de % de transmissão e/ou absorbância.

A absorbância também é conhecida como densidade óptica (OD).

Quanto mais luz passar, menos luz a amostra absorve. Em geral, você anotará os valores de absorbância, que geralmente serão dados como decimais. Por exemplo: 0,43.

Se você obtiver um resultado anormal (como 0,900, enquanto o resto está em torno de 0,400), dilua a amostra e meça a absorbância novamente.

Repita a medição para cada amostra individual pelo menos três vezes e faça a média das medições. Isso fornece uma leitura mais precisa.

Imagem intitulada Do Spectrophotometric Analysis Step 10

5. Repita o teste com comprimentos de onda sucessivos de luz. Sua amostra pode conter vários compostos desconhecidos cuja absorbância varia dependendo do comprimento de onda. Para descartar a incerteza, repita as medições em intervalos de 25 nm em todo o espectro. Desta forma, você pode detectar outros produtos químicos que suspeita estarem no soluto.

Parte 3 de 3: Analisando os dados de absorbância

Imagem intitulada Do Spectrophotometric Analysis Step 11

1. Calcule a transmissão e a absorbância da amostra. A transmissão indica quanto da luz que passou pela amostra atingiu o espectrofotômetro. Absorção é quanto da luz foi absorvida por um dos produtos químicos no soluto. Muitos espectrofotômetros modernos exibem transmissão e absorção, mas depois de registrar a intensidade, você pode calcular esses valores.

A transmitância (T) é encontrada dividindo-se a intensidade da luz que passou pela solução da amostra pela quantidade que passou pelo branco. Geralmente é expresso como um decimal ou como uma porcentagem. T = I/I₀ onde I é a intensidade da amostra e I₀ a intensidade do vazio.
A absorbância (A) é expressa como o negativo do logaritmo (expoente) do valor de transmissão (base-10): A = -log₁₀t. Para um valor T de 0,1, o valor de A é 1 (0,1 é 10 elevado à -1ª potência), o que significa que 10% da luz é transmitida e 90% é absorvida. Para um valor T de 0,01, o valor de A é 2 (0,01 é 10 elevado à -2ª potência), o que significa que 1% da luz é transmitida.

Imagem intitulada Do Spectrophotometric Analysis Step 12

2. Plote os valores de absorbância em relação aos comprimentos de onda. O valor de absorbância é plotado no eixo y vertical em relação ao comprimento de onda da luz usado para um teste específico plotado no eixo x horizontal. Traçar os valores máximos de absorbância para cada comprimento de onda da luz testada produz o espectro de absorbância da amostra e identifica os compostos que compõem o produto químico de teste e suas proporções.

Um espectro de absorção geralmente tem picos em certos comprimentos de onda que permitem identificar compostos específicos.

Imagem intitulada Do Spectrophotometric Analysis Step 13

3. Compare seu gráfico de espectro de absorção com gráficos conhecidos de compostos específicos. Os compostos têm um espectro de absorção único e sempre produzirão um pico no mesmo comprimento de onda toda vez que forem medidos. Ao comparar seus gráficos de compostos desconhecidos com os de compostos conhecidos, você pode identificar os solventes que compõem sua solução.

Você também pode usar este método para identificar contaminantes em sua amostra. Se você espera um pico claro em um determinado comprimento de onda e obtém dois picos em comprimentos de onda diferentes, então você sabe que algo está errado em sua amostra.